考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理、步驟及注意事項(xiàng)

關(guān)鍵詞：紫外分光光度計(jì)；蛋白質(zhì)濃度；美析儀器； UV-1100;UV-1200

      蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的方法有很多，考馬斯亮藍(lán)測(cè)定蛋白質(zhì)是實(shí)驗(yàn)室zui常見(jiàn)的一種方式，它利用比色法和色素法混合方法、操作簡(jiǎn)便，下文介紹了考馬斯亮藍(lán)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理、優(yōu)缺點(diǎn)、操作以及注意事項(xiàng)。

實(shí)驗(yàn)原理

      考馬斯亮藍(lán)(Coomassie Brilliant Blue)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)―染料結(jié)合的原理，定量的測(cè)定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。這種蛋白質(zhì)測(cè)定法具有超過(guò)其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度zui高的蛋白質(zhì)測(cè)定法。

      考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的zui大吸收峰(lmax)的位置，由465nm變?yōu)?595nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。通過(guò)測(cè)定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。研究發(fā)現(xiàn)，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。

考馬斯亮藍(lán)染色法的突出優(yōu)點(diǎn)是：

      (1)靈敏度高，據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍，其zui低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1mg。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。

      (2)測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過(guò)程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性。因而*不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。

      (3)干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測(cè)定法。

此法的缺點(diǎn)是：

      (1)由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考馬斯亮藍(lán)染色法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用g—球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。

      (2)仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉(SDS)等。

試劑與器材

一、試劑

考馬斯亮藍(lán)試劑：

考馬斯亮藍(lán)G―250 100mg溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1000mL。

二、標(biāo)準(zhǔn)和待測(cè)蛋白質(zhì)溶液

1.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液

      結(jié)晶牛血清蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量，根據(jù)其純度用0.15mol/L NaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。

2.待測(cè)蛋白質(zhì)溶液。

      人血清，使用前用0.15mol/L NaCl稀釋200倍。

三、器材

      試管1.5×15cm(×6)，試管架，移液管管0.5mL(×2);1mL(×2);5mL(×1);恒溫水浴;分光光度計(jì),美析UV-1100;UV-1200。

操作方法

一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

取7支試管，按下表平行操作。

試管編號(hào)                      0   1     2       3       4       5       6

標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（mL）      0  0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06

                              0.1   0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04

考馬斯亮藍(lán)試劑（mL）        5mL

搖勻，1h內(nèi)以0號(hào)管為空白對(duì)照，在595nm處比色

A595nm                                                   

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以A595nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

二、未知樣品蛋白質(zhì)濃度測(cè)定

      測(cè)定方法同上，取合適的未知樣品體積，使其測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍內(nèi)。根據(jù)所測(cè)定的A595nm值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量，從而計(jì)算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)。

注意事項(xiàng)

      在試劑加入后的5-20min內(nèi)測(cè)定光吸收，因?yàn)樵谶@段時(shí)間內(nèi)顏色是zui穩(wěn)定的。

測(cè)定中，蛋白-染料復(fù)合物會(huì)有少部分吸附于比色杯壁上，測(cè)定完后可用乙醇將藍(lán)色的比色杯洗干凈。

       利用考馬斯亮藍(lán)法分析蛋白必須要掌握好分光光度計(jì)的正確使用，重復(fù)測(cè)定吸光度時(shí)，比色杯一定要沖洗干凈，制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的時(shí)候，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品是從低濃度到高濃度測(cè)定，防止誤差。